笑松：漫漫求索路 一一 征服肝炎病毒的艰难历程（一）
有一种病毒引起的传染病累及10%的中国人，从婴儿到老人都不能幸免。感染的人数冠于全球，被称为“中国第一病”，这就是乙型肝炎。
能引起肝炎的病毒有甲、乙、丙、丁、戊五型。各型病毒感染后的急性期症状大同小异。最明显的症状是黄疸，即皮肤、巩膜呈现黄色，尿液颜色转深。但黄疸并不出现在所有病人身上。此外还有疲倦、厌食、上腹疼痛等等。这些肝炎病毒传染的途径和预后不同。甲型和戊型通过粪-口途径传染，感染后潜伏期和病程较短，预后良好，绝大多数患者能自行痊愈，病毒被清除，不会转变成慢性感染。乙型和丙型通过血液和身体的密切接触传染，潜伏期较长。丙型肝炎病毒感染后绝大多数发展为慢性，患者终身携带病毒。乙型肝炎的预后则视感染时的年龄而定。携带乙肝病毒的产妇在分娩过程中可通过其血液将病毒传给新生儿，使之成为终身病毒携带者，多数没有临床症状，但可将病毒传给他人。成年人被乙肝病毒感染，发生急性肝炎后，大多数人能将病毒清除，只有10%转变为慢性。丁型肝炎病毒是一种不完全的病毒，通过血液传染，但只能感染乙肝病毒携带者。
五种肝炎中最常见的是甲、乙、丙三型，危害最大的则是乙型和丙型，因为慢性乙型和丙型肝炎有可能诱发肝硬化，乃至肝癌，严重影响患者的健康和生命。这些肝炎病毒的发现以及相关疫苗和治疗药物的开发，堪称120多年的病毒学史上历时最长，过程最为艰巨曲折，而且至今尚未结束的探索。
发现篇
与艾滋病等20世纪以来的新现传染病不同，肝炎是一种古老的疾病。西亚两河流域地区四千多年前的古巴比伦泥板上的医学典籍，以及两千多年前中国的《黄帝内经》，都记载了肝炎的主要症状——黄疸。清代沈金鳌编撰于1773年的《沈氏尊生书》中有“黄疸”一节，描述了黄疸病的传染性和严重性。19世纪到20世纪初，黄疸病肆虐于欧美各国。美国南北战争时期（1861 – 1865年）的南北两军都有大量的黄疸病人，仅北军的医务部门正式记录在案的黄疸病人就有87236例。第一次世界大战期间（1914 – 1918年），各交战国的前线参战部队以及后方都市平民中都曾有多次黄疸病的爆发流行。当时的主流医学界错误地认为黄疸的起因是肠粘膜的病变。直到病理学家解剖检查了有黄疸的死亡士兵尸体，才注意到肝脏的病变。1930年代，两名丹麦医生使用中空针头成功取得肝脏活检标本，由此确立了黄疸是由肝脏的炎症引起的。不过当时对于肝炎的病原体和传播方式还一无所知。
19世纪末到20世纪上半叶见证了现代医学的快速发展。注射器的发明和药物针剂、输血和血液制品，以及各类疫苗的开发和推广使用，拯救了无数的生命。与此同时，医学界也注意到这些治疗和预防措施有时能导致肝炎。病人接受输血后发生的肝炎成为临床上一个棘手的难题。除此之外，当时的一些疫苗产品，例如黄热病疫苗，含有人血清作为稳定剂。黄热病是一种通过蚊虫叮咬传播的病毒性传染病，主要流行于非洲及中南美洲的热带地区。1942年，美国军方决定给所有将被部署到海外黄热病疫区的部队接种黄热病疫苗，结果总共诱发了五万例急性肝炎。仅路易斯安那州的波尔克军营一处，同一天内曾经给五千名士兵接种了疫苗，其中一千人随后出现黄疸。
种种迹象表明，肝炎有可能通过血液、血液制品、或者未经彻底消毒即重复使用的注射器传染，于是通过这些途径传染的肝炎就被称为“血清性肝炎”，以区分于先前所知的“传染性肝炎”。由于这些肝炎的病原体仍属未知，也就无从鉴别出带有传染性的供血者和血液样品。寻找肝炎病原体已经成为刻不容缓的紧急任务了。
1892年，俄国植物学家伊凡诺夫斯基（Dmitri Ivanovskii）发现了第一种比细菌还小，可以通过特殊的陶瓷滤器的生物——烟草花叶病病毒。20世纪初，医学研究人员已经可以从不同疾病患者身上取得各种标本（例如血液或鼻咽灌洗液），滤除细菌，然后接种到实验动物身上，复制出病人的临床症状，从而确定人类的一系列传染病是由病毒引起的，包括狂犬病、脊髓灰质炎（小儿麻痹症）、流感，等等。到了1930年代，研究人员进一步发现流感等疾病的病毒可以在鸡胚（即孵化过程中的受精鸡蛋）中繁殖扩增，大量产生。直到今天，每年用来制造流感疫苗的病毒主要还是用这种方法生产的。然而这一切研究手段对于肝炎病原体的鉴别，都没有起到任何作用，尤其是还没有找到一种合适的动物，可以作为肝炎的疾病模型。于是研究人员想到了直接用人体来进行肝炎接种实验。
二次大战期间，美国军队受到肝炎流行造成部队减员的严重影响。为了寻求控制肝炎流行的方法，军方开始利用志愿受试者来进行肝炎接种实验。所招募的受试者有些是在监狱服刑的囚犯，有些是出于个人信仰，拒服兵役的征兵对象，或者拒绝执行战斗任务的士兵。根据战时法律，这些人可以通过选择到某些非战斗性岗位服务，或者充任医学实验的受试者，来换取免遭刑罚。为了确定肝炎的传染方式，军方研究人员从肝炎患者取得粪便、血清、鼻咽灌洗液和尿液，经处理后通过不同途径接种到实验对象身上，然后观察他们发病的情况。
到了1950年代中期，美国纽约大学医学院的儿科医生克鲁格曼（Saul Krugman）在纽约州的柳溪学校以集中收养的智障儿童为实验对象，进一步用肝炎患者的粪便抽提物和血清进行了一系列的接种实验，历时十余年，先后有700多名智障儿童被作为受试者。
以上这些人体实验的结果清楚地表明，“传染性肝炎”和“血清性肝炎”都是由病毒引起的，前者通过粪-口途径传染，后者通过血液传染。这两种肝炎痊愈后患者血液中都出现抗体，能保护康复病人，防止他们再次罹患同一种肝炎。但是所得到的免疫力没有交叉保护作用，表明两种肝炎的病原体是截然不同的两种病毒，亦即后来发现的甲型和乙型肝炎病毒。
这些人体接种实验，尤其是克鲁格曼的智障儿童肝炎接种实验，明显有悖于当今社会普遍接受的人类医学研究的伦理准则；但在当时的历史条件下，这些实验为甲型和乙型肝炎病毒的最终发现以及疫苗的开发作出了重要的贡献，也是不争的事实（参阅： 笑松：人道乎，不人道乎？——谈谈人体医学实验的伦理问题。http://hx.cnd.org/?p=168197）。
肝炎接种实验虽然证明了两种肝炎病毒的存在，却没有揭示这些病毒的庐山真面目。这就像在一座城市中发生了一系列刑事案件，警察通过调查确认了这些罪案分别是两名罪犯所为，但罪犯的身份却还没有确定，自然也就谈不上将他们逮捕归案，消除治安隐患。这一目标的最终实现，首先应归功于美国遗传学家布伦堡（Baruch Blumberg）。可是他直到自己锲而不舍的努力的最后阶段，才意识到所做的工作与肝炎有如此重大的关系。
1960年代，正当克鲁格曼医生在柳溪学校忙于他的肝炎接种实验时，布伦堡博士热衷于研究的是与之风马牛不相及的另一个问题：遗传因素造成的不同人种的血清中所含蛋白质成分的差异。
布伦堡对这个问题的兴趣，始于他在哥伦比亚大学医学院的学生时代。三年级过后的暑假，他参加了一位教授指导的研究课题。教授是个寄生虫病专家，派他出差到南美州苏里南的一个偏远矿区工作了几个月，因为那里流行一种由血丝虫感染引起的疾病，称为象皮病。当地居民的族裔成分十分复杂，包括印尼裔、华裔、非裔、印度裔、犹太裔，等等。布伦堡注意到，不同族裔对血丝虫病的易感程度差别很大。
当时医学界已经知道人类不同个体的某些蛋白质在大小、形状上可以不完全相同，使得其功能也略有差异。这就是蛋白质的多态性。布伦堡猜测，由遗传因素决定的蛋白质多态性可以影响对血丝虫病，以及其他疾病的易感率。从医学院毕业以后，他先后在美国和英国的几个机构继续这项研究，为此旅行到世界各地，从不同族裔人群中采集了大量的血清样品，仔细地分析比较。他发现由于血清蛋白质成分的差异，人体在接受输血后，有可能产生针对来自供血者的异种蛋白质（异种抗原）的抗体。在那些为了治疗某些疾病，例如血友病，需要经常接受输血的病人中，产生这类抗体的机会特别高。这些病人的血清就被布伦堡作为工具，用来识别不同个体之间血清蛋白质的差异成分。
1964年，布伦堡加入了美国费城的一家癌症研究所，与美国国立卫生研究院（NIH）一位年轻的研究人员阿尔特（Harvey Alter）合作进行研究。他们利用纽约市一名血友病患者的血清中所含的抗体，发现在一名澳大利亚土著居民的血清中，有一种前所未知的新抗原。这个新抗原被命名为澳大利亚抗原，简称澳抗。进一步的分析发现，澳抗在美国的一般人群中比例很低，唯独在白血病患者中的比例很高。
为了解释这一现象，布伦堡提出一个假设：有一种遗传因素，即基因，使人一方面带有澳抗，另一方面容易罹患白血病。如果这一假设是正确的，那么在白血病的高危人群（即特别容易患白血病的一群人）中，澳抗阳性的比例也应该较高。唐氏综合症是一种由于染色体异常引起的先天性疾病。当时的医学界已经知道，唐氏症儿童患白血病的几率高出正常儿童二十倍以上。于是布伦堡也将注意力投向一家智障儿童收养院中的唐氏症患儿。结果发现，这些孩子的澳抗阳性率果然高达30%，而且血清中澳抗的有无似乎是稳定不变的（由遗传基因决定的性状当然应该是这样）。这些初步观察结果与他的假设显得十分一致。
然而随着检测范围的扩大，布伦堡发现，澳抗并不仅仅存在于白血病的高危人群，而是在多种不同的病人群体中都能检出。他还发现澳抗在亚洲、非洲、大洋洲的居民中很普遍，阳性率约为10%。看来澳抗与白血病关系的假设是站不住脚的。
就在这时，两个偶然发现的肝炎病例，将布伦堡的研究引向一个全新的方向。布伦堡的实验室中有个女技术员，擅长从澳抗阳性的血清中提取纯化的澳抗样品，用于各种实验。她经常用自己的血清作为澳抗阴性的实验对照。有一天她感觉不适，而且出现黄疸症状。当她再次采集自己的血清来测定澳抗时，发现已转为阳性。另外一个病例是澳抗阴性的唐氏症患者。在被追踪研究期间得了肝炎，伴随着肝炎症状的出现，澳抗由阴转阳。布伦堡于是恍然大悟，将澳抗与肝炎联系起来（1）。
与此同时，纽约血液中心有个研究人员名叫普林斯（Alfred Prince），也利用来自一名接受过多次输血治疗的血友病人的血清抗体，在一批输血后肝炎患者的血液中找到一种与肝炎密切相关的新抗原。普林斯将它命名为“血清性肝炎抗原”，在 1968年7月发表了这个结果（2）。一个月后，他又在《柳叶刀》发表了一篇短通讯，报告他通过比较自己所用的抗体与布伦堡所用的澳抗抗体，发现“血清性肝炎抗原”其实就是已知的澳抗（3）。
布伦堡博士无心插柳柳成荫，从一个遗传学家，病毒学的门外汉，一个华丽转身成为公认的肝炎病毒研究的先驱， 并因此荣获1976年的诺贝尔医学奖。获奖理由是他“发现了澳大利亚抗原，并且证明它与……血清性肝炎的联系”(4)（尽管有人认为普林斯对证明这一联系的贡献比布伦堡更大）。他的故事生动地显示了科学研究的基本方法：从观察的现象出发，提出假设，进行实验，根据结果修正原先的假设，再进行新的实验，如此往复循环，逐步形成正确的理论。布伦堡最初认为澳抗与白血病受同一种遗传因素控制，这个假设显然是错误的（其实是白血病人由于治疗需要经常接受输血，因此受乙型肝炎病毒感染的机会大增），但这并不妨碍一个优秀的科学家通过周密的实验和细致的分析，最终洞察真理。这样的事例在科学史上是屡见不鲜的。
紧随着布伦堡和普林斯的发现，哥伦比亚大学医学院的教授戈克（David Gocke）带领两名学生格林堡（Harry Greenberg）和卡維（Neil Kavey）进行了一项重要的研究。他们将纽约市一家医院血库所保存的，已被用于输血的2211份血液样品逐一测定澳抗，鉴定出一批阳性血样和阴性血样，然后追踪研究接受了这些血液的病人，了解他们输血后是否发生了肝炎。格林堡的任务之一，就是开着戈克教授借给他的一部红色敞篷跑车，跑遍纽约市的大街小巷，去寻访那些输血病人。几十年后，格林堡回忆道：“敲开门一看，主人一脸蜡黄，我就想，又找到了一个！”
师生三人联手努力，发现在12名接受了澳抗阳性血液的输血病人中，有9人发生输血后肝炎，其中7人是澳抗阳性；而在69名接受了澳抗阴性血液的输血病人中，只有4例输血后肝炎。这个结果于1969年在《柳叶刀》发表（5）。它第一次表明，澳抗极有可能是具有乙型肝炎传染性的血液所含的一种标志性蛋白质。这项工作也成为格林堡成果累累的病毒学研究生涯的发端。
尽管此时澳抗的本质还不为人了解，阿尔特已经敏锐地意识到，对供血者普遍进行澳抗的筛选，将有助于避免输血后肝炎的发生，并开始为此发声呼吁（6）。
澳抗究竟是乙型肝炎的病原体，还是人体患乙型肝炎后产生的一种蛋白质？换句话说，澳抗是乙型肝炎的原因，还是肝炎造成的结果？布伦堡坚信前者是正确的答案，但他没有可靠的证据。要回答这个问题，最直接的方法自然是将乙肝患者血液中的澳抗分离出来，接种到合适的宿主中，看看是否能引起乙型肝炎。可是此时克鲁格曼的肝炎接种实验已经遭到越来越强烈的批评，难以再进行类似的人体实验。而除了人类之外，当时又不知道是否有任何动物可以感染乙型肝炎，供人进行实验。
1970年，英国病毒学家丹恩（David Dane）利用一项新问世的电子显微镜技术，把澳抗的研究又推进一步。当一个抗原分子遇到它的特异性抗体分子时，二者相互结合，形成所谓的抗原-抗体免疫复合物。抗体分子的形状类似于大写字母Y，字母分叉的两个顶端各有一个抗原结合位点，可以分别结合一个抗原分子。电子显微镜的放大倍数远远超过光学显微镜，后者只能看到细菌，前者可以看到病毒，但还不足以看到比病毒更小得多的单个抗原或者抗体分子。可是如果抗原分子是由某种尺寸较大的结构（例如病毒颗粒）所携带，而且每个颗粒上带有多个抗原分子，那么当抗原和抗体以一定的比例相混合时，单个的抗原颗粒就会被抗体分子通过它的两个结合位点拉拢到一起，在电子显微镜下看到的将是大量颗粒的聚集体；如果不加抗体，看到的则只是分散的单个颗粒。这就是所谓免疫电镜术，它使得研究人员可以清楚地看到并且鉴别带有某种特殊抗原的病毒颗粒。
丹恩将一名澳抗阳性的肝炎病人血清样品与澳抗抗体混合后，果然在电镜下看到了大量聚集在一起的球状颗粒，颗粒直径约为20纳米。这会不会就是显露原形的乙型肝炎病毒呢？且慢，除了这些20纳米的颗粒之外，他还看到了另一种大得多的颗粒，直径为42纳米，但是数量少得多，只有前者的三千分之一，被称为丹氏颗粒（7）。在电镜下，丹氏颗粒有一个清晰可见的核心。另一位英国病毒学家阿尔梅达（June Almeida）用去污剂处理丹氏颗粒，除去它的外层，就得到直径为27纳米的核心颗粒，并且通过免疫电镜术发现核心颗粒的抗原成分不同于澳抗（8）。至此，有关澳抗的图像终于清晰起来：丹氏颗粒包含两层蛋白质结构，外壳由澳抗组成，核心是另一种蛋白质，称为核心抗原。病人感染乙型肝炎后，血液中都会出现针对这一核心成分的抗体，而且在肝炎痊愈以后抗体并不消失。于是丹氏颗粒的核心抗原就被称为乙型肝炎核心抗原。澳抗则被正式命名为乙型肝炎表面抗原，它在血液中随着肝炎的发生而出现，肝炎痊愈后则消失。
丹氏颗粒的这种双层结构与当时已知的一些其他病毒类似，这一点强烈地提示丹氏颗粒是引起乙型肝炎的病毒，感染肝脏细胞后，由于某种原因，病毒复制产生的表面抗原蛋白质分子大大多于包装新合成的病毒核心颗粒所需要的数量，多余的表面抗原分子就形成不带核心的20纳米颗粒，释放到血液中。不过病毒颗粒除了蛋白质的核心和外壳，还应该含有一个携带遗传信息的关键成分，就是核酸，它可以是DNA，或者RNA。只有找到这些核酸，才能确认丹氏颗粒是完整的病毒颗粒。可是丹氏颗粒在病人血清中的含量很低，又无法在实验动物或体外培养的细胞中大量扩增，以1970年代初的技术水平，要想依靠传统的生物化学手段，从丹氏颗粒中分离出它的核酸成分来直接进行研究，谈何容易。
直接的手段行不通，研究人员转而求诸间接的策略：首先寻找病毒核酸复制所需要的酶。通过这个途径取得重要突破的，是斯坦福大学的病毒学家罗宾逊 （William Robinson）。1973年，罗宾逊教授发现丹氏颗粒内带有病毒的DNA聚合酶；一年以后，又发现了这种酶合成的产物——病毒DNA。这一发现的过程揭示了乙型肝炎病毒一个很特别的性质：在被感染的肝细胞内完成复制及包装后释放到血液中的丹氏颗粒，所含有的病毒DNA并不是完整的双链分子，而是带有部分的单链。用离心机将肝炎病人的血清以高速旋转，使病毒颗粒沉淀到离心管底部，回收后置于试管中，只需要加入合成DNA所需的小分子原料，丹氏颗粒中的病毒DNA聚合酶就会以DNA上的单链部分为模板，合成完整的双链病毒DNA。所加入的原料分子带有放射性同位素的标记，使得合成的双链DNA分子能够以极高的灵敏度被探测到（9）。这一结果不仅证明了乙肝病毒DNA的存在，而且可以通过测定新合成的双链DNA产物的放射性强度，来估计血清中丹氏颗粒的承载量。在DNA聚合酶链式反应（PCR）技术发明之前，这个方法在乙肝病毒研究中发挥了重要作用。
乙型肝炎病毒完整图像的拼图板块，就这样一片一片地落到正确的位置上。但是罗宾逊教授坚持认为，要确认这个病毒就是乙型肝炎的病原体，还需要证明他得到的病毒DNA的确承载着肝炎病毒的遗传信息，可以指导合成病毒颗粒的所有蛋白质组分，使它们能装配成有传染性的乙型肝炎病毒。可是他能得到的病毒DNA数量实在有限，不足以用来进行这些研究。怎样才能实现这个目标？
（待续）
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