柳涯客: 关于提高新型冠状病毒核酸阳性检出率以及速度的对策(草稿)

关于提高新型冠状病毒核酸阳性检出率以及速度的对策(草稿)

作者：柳涯客

目前，新型冠状病毒的疫情仍然十分严重，截至3月9日，中国确诊病例37288，疑似病例28988，死亡813例。湖北省委书记蒋超良2月8日要求：“两天内检测完武汉所有疑似患者”。而工程院的副院长、中国医学科学院院长王辰院士接受央视《新闻1+1》采访披露：“目前核酸检测的阳性率只有30-50%”。也就是说，同一个临床疑似肺炎病人，检测2-3次才有一次阳性结果。

据我的了解，现时武汉的日均核酸检测能力只有6000/天。从疫情公布以来，疑似病例数和确诊病例每日攀升，要完成湖北省委书记蒋超良2月8日要求只有靠CT检查。那么，有没有可能两天内检测完武汉所有疑似患者？完全可能，但我们需要改进核酸检测的技术和方法。

核酸检测的主要问题是阳性率低和检测速度跟不上。最敏感的核酸检测实时RT-PCR方法大概只能检出5个病毒以上的感染。病毒感染在下呼吸道（包括肺），现在取样主要是咽拭子，少部分病人的痰和肺泡灌洗液。肺泡灌洗液的阳性率最高，但时间长，技术要求高，无法推广。新型冠状病毒感染者以干咳为主，痰少取不到样。

我们需要成立科技攻关小组，做多方面的尝试，攻克核酸检测的技术和方法的限制，在近期集中解决几个重要的问题, 我的分析和对策是：

1. 为了提高阳性检出率，改进取样

1）改进取样方法，采用标准和多个拭子取样点

取样病毒量少是核酸检测阳性率低的关键原因。鼻拭子和咽拭子说白了就是护士拿棉签刮一下鼻和咽送检。另外病程的时间段（早期，中期和危重期), 刮的位置和手法个人不同也是导致30-50%阳性率的原因。提高检出率的核心在于提高病毒取样量。

如果采用标准取样点，固定取样的位置，如口腔9点，12点位等，可以避免护士刮的位置和手法不同所造成的采样差异。另外建议多个拭子取样（2-5个）可以增加病毒数量2-5倍，提高阳性率。

由于鼻腔更接近下呼吸道，因而鼻拭子的阳性率可能好于咽拭子，所以建议改为鼻拭子，可以与咽拭子做比较。

2）改进拭子材料

棉签虽然方便，但取样后不易洗脱病毒，效率受到影响，将来争取用易裂解的材料作拭子, 不洗脱，可以提高病毒的数量。

3）改进取样途径

轻症病人增设洗鼻液，漱口液; 肺炎病人增设血液。显然，肺泡灌洗液不适合轻症病人，那么，洗鼻液和漱口液就值得尝试了。洗鼻的方法如同过敏性鼻炎的洗鼻。洗鼻液和漱口液离心2分钟 (10000RCF) 收集细胞。我觉得洗鼻液的阳性率可能会比鼻拭子高。将来开发病毒吸附剂可能改善富集方法，增加病毒数量。

虽然血液细胞不是病毒最易感的细胞（肺泡细胞是），但肺的血液供应非常丰富。人体器官中心脏、胰脏、肾脏、胃脏、脾脏、肺部、肠道、膀胱在生命活动过程中都会耗氧，心脏不是全身耗氧量最高的器官，肺部器官耗氧最多。因此，如果新型冠状病毒感染到肺，收集肺炎病人的血做核酸检测就十分合理。但是，2020年1月24日发表在Lancet的文章中用了住院肺炎病人的血做核酸检测，阳性率为15%。是不是不值得提倡？在我看来，他们的方法不是最好，可以改进，例如加大血的用量（从80微升加大为240微升），最后洗脱溶液减少（50微升变为10微升），这样的改进可以提高病毒数量15倍。即使是15%阳性率，依然可以作为补充。

4）避免运输和待检过程降解

运输和待检过程长达数小时至2天，期间的病毒RNA降解也是需要考虑的因素，我的对策是：提取RNA 之前采样和病毒灭活由护士进行，然后密封常温运输至检测室，加病毒灭活溶液后能防止病毒RNA降解。

2. 提高新型冠状病毒核酸检测速度

为什么武汉的日均核酸检测能力只有6000/天？限速环节主要在于操作安全等级和核酸提取。我的改进对策有这几个方面：

1）扩大符合要求的生物检测室

新型冠状病毒在中国定为乙类甲管，即国家卫健委应急办主任许树强介绍的“国务院已经将新型冠状病毒感染的肺炎纳入法定的传染病，定为乙类甲管，即乙类传染病按照甲类传染病的预防控制措施进行管理”。但是预防控制可以，核酸检测就不必参照甲类。

2020年1月16日前，即使1月7日新型冠状病毒的基因序列公布后，数家公司在几天内推出检测试剂盒（最快的24小时后出产品）获得快速批准，但中国所有的新型冠状病毒核酸检测都要求送到北京疾控中心（中国CDC）检测，此后虽然下放了权限，但符合P3安全等级的生物实验室数目有限。样品低温运输也很不方便。

美国FDA2月4日前，所有的新型冠状病毒核酸检测都要求送到美国疾控中心（CDC）检测，等待时间为2-5天。FDA2月4日紧急下放检新型冠状病毒测权限到各地区CDC核准授权实验室，加快了检测进程(附1, 2)。但是美国只有12例感染者，没有太大的检测需求。

我的建议：病毒灭活由护士病人采样后迅速进行，然后密封常温运输至“云神山检测室”进行核酸提取。也可以考虑此后逐次降低安全等级，后面的在安全等级稍低的生物试验室进行检测。云神山检测室是我起的名字，大概可以容纳100个检验员，每个人8小时可以提取200个样品的核酸。

2）检验员人数

找不到足够检验员怎么办，武汉有60多家医院，每个医院抽3个人不难。全国已支援万多医务人员，增加支援200个检验员应该可行, 这样就是200人。另一个选择则是招募200个生物研究生或医学本科生（上过生物实验科），培训半天就可以胜任。

3）检测机器数量

一个人和一台机器实时PCR仪8小时大概能人工检测650-1000个样品，样品检测后消毒就行。小型机器人就更快了，每台仪器可做10000个样品/天。

4) 病毒灭活剂 (TRIZOL)

病毒灭活剂 (TRIZOL)的主要成分是苯酚。苯酚的作用是裂解细胞，使细胞中的蛋白变性，释放核酸物质 (RNA)。由于苯酚不能完全抑制RNA酶活性，TRIzol中还加了8－羟基喹啉、异硫氰酸胍、贝塔巯基乙醇等来抑制内源和外源RNA酶。参见附3, 微量总 RNA 提取试剂盒及方法。

总之，100个检验员15台机器一天就可以人工检测2万个样品, 我觉得200人30台机器一天检测4万样品应该能够实现。

以上是我的关于提高新型冠状病毒核酸阳性检出率和速度的对策，希望转贴或转告。只要有关国家或武汉市领导能够看到并考虑提高新型冠状病毒核酸阳性检出率和速度, 也是我们大洋彼岸华人科学家为战胜新型冠状病毒疫情出的一分力。

2-9-2020

附1：CDC-2019-nCoV-Authorization

附2: 美国FDA紧急授权通知(机器翻译版)

附3: 微量总 RNA 提取试剂盒及方法, 根据Huang C 等(Lancet. 2020 Jan 24) 方法改编

 

如没有特别兴趣以下附件可以略过

附1. CDC-2019-nCoV-Authorization

Robert R. Redfield, MD
Director

Centers for Disease Control and Prevention 1600 Clifton Rd., MS D-14

Atlanta, GA 30333

Dear Dr. Redfield:

This letter is in response to your request that the Food and Drug Administration (FDA) issue an
Emergency Use Authorization (EUA) for emergency use of the Centers for Disease Control and
Prevention (CDC) 2019-Novel Coronavirus (2019-nCoV) Real-Time Reverse Transcriptase

(RT)-PCR Diagnostic Panel for the presumptive qualitative detection of nucleic acid from the
2019-nCoV in upper and lower respiratory specimens (such as nasopharyngeal or
oropharyngeal swabs, sputum, lower respiratory tract aspirates, bronchoalveolar lavage, and
nasopharyngeal wash/aspirate or nasal aspirate) collected from individuals who meet CDC
criteria for 2019-nCoV testing, pursuant to Section 564 of the Federal Food, Drug, and
Cosmetic Act (the Act) (21 U.S.C. §360bbb-3).  Testing is limited to qualified laboratories
designated by CDC and, in the United States, certified under the Clinical Laboratory
Improvement Amendments of 1988 (CLIA), 42 U.S.C. § 263a, to perform high complexity
tests.¹

On Feburary 4, 2020, pursuant to Section 564(b)(1)(C) of the Act, the Secretary of the

Department of Health and Human Services (HHS) determined that there is a public health

emergency that has a significant potential to affect national security or the health and security of United States citizens living abroad, and that involves the 2019-nCoV.  Pursuant to Section 564 of the Act, and on the basis of such determination, the Secretary of HHS then declared that
circumstances exist justifying the authorization of emergency use of in vitro diagnostics for detection and/or diagnosis of the novel coronavirus (2019-nCoV) subject to the terms of any authorization issued under Section 564(a) of the Act.²

 

Having concluded that the criteria for issuance of this authorization under Section 564(c) of the
Act are met, I am authorizing the emergency use of the CDC 2019-nCoV Real-Time RT-PCR
Diagnostic Panel (as described in the scope Section of this letter (Section II)) in individuals who

 

¹ For ease of reference, this letter will refer to “qualified laboratories designated by CDC and, in the United States, certified under the Clinical Laboratory Improvement Amendments of 1988 (CLIA), 42 U.S.C. § 263a, to perform high complexity tests” as “authorized laboratories.”

² U.S. Department of Health and Human Services, Determination of a Public Health Emergency and Declaration that Circumstances Exist Justifying Authorizations Pursuant to Section 564(b) of the Federal Food, Drug, and Cosmetic Act, 21 U.S.C. § 360bbb-3. Feburary 4, 2020

 

Page 2 - Dr. Redfield, Centers for Disease Control and Prevention

 

meet CDC criteria for 2019-nCoV testing for the presumptive detection of 2019-nCoV by authorized laboratories, subject to the terms of this authorization.

I. Criteria for Issuance of Authorization

I have concluded that the emergency use of the CDC 2019-nCoV Real-Time RT-PCR

Diagnostic Panel in individuals who meet CDC criteria for 2019-nCoV testing meets the
criteria for issuance of an authorization under Section 564(c) of the Act, because I have
concluded that:

1.  The 2019-nCoV can cause a serious or life-threatening disease or condition, including
      severe respiratory illness, to humans infected by this virus;

2.  Based on the totality of scientific evidence available to FDA, it is reasonable to believe
      that the CDC 2019-nCoV Real-Time RT-PCR Diagnostic Panel may be effective in

diagnosing 2019-nCoV infection, and that the known and potential benefits of the CDC 2019-nCoV Real-Time RT-PCR Diagnostic Panel, when used for diagnosing 2019-nCoV infection, outweigh the known and potential risks of such product; and

3.  There is no adequate, approved, and available alternative to the emergency use of the
      CDC 2019-nCoV Real-Time RT-PCR Diagnostic Panel for diagnosing 2019-nCoV

infection.³

II. Scope of Authorization

I have concluded, pursuant to Section 564(d)(1) of the Act, that the scope of this authorization is limited to the use of the authorized CDC 2019-nCoV Real-Time RT-PCR Diagnostic Panel by authorized laboratories for the presumptive detection of 2019-nCoV in individuals who meet CDC criteria for 2019-nCoV testing.

 

The Authorized CDC 2019-nCoV Real-Time RT-PCR Diagnostic Panel

 

The CDC 2019-nCoV Real-Time RT-PCR Diagnostic Panel is for the presumptive detection of
2019-nCoV RNA in upper and lower respiratory specimens (such as nasopharyngeal or
oropharyngeal swabs, sputum, lower respiratory tract aspirates, bronchoalveolar lavage, and
nasopharyngeal wash/aspirate or nasal aspirate), and other authorized specimens collected from
individuals who meet CDC criteria for 2019-nCoV testing.  The testing procedure consists of
nucleic acid extraction and purification from the human specimen using authorized extraction
methods/instruments followed by real time RT-PCR, where the RNA is reverse transcribed into
cDNA and then amplified using the primer sets and detected using specific probes.  The real time
reverse transcriptase (RT)-PCR is performed on the FDA cleared Applied Biosystems 7500 Fast
Dx Real-Time PCR Instrument with SDS 1.4 software, or other authorized instruments or
software.

The CDC 2019-nCoV Real-Time RT-PCR Diagnostic Panel includes the following materials or other authorized materials:

 

³ No other criteria of issuance have been prescribed by regulation under Section 564(c)(4) of the Act. 

 

Page 3 - Dr. Redfield, Centers for Disease Control and Prevention

 

 

·     2019-nCoV_N1, 2019-nCoV_N2 and 2019-nCoV_N3 vials containing primers and

probes that target the nucleocapsid (N) gene and are designed for both universal

detection of SARS-like coronavirus as well as specific detection of the 2019-nCoV
·   RP vial containing the internal control primers and probes that target the Human
      RNase P gene

·   nCoVPC vial containing the 2019-nCoV positive control used in the assay

 

The CDC 2019-nCoV Real-Time RT-PCR Diagnostic Panel also requires the use of additional authorized materials and authorized ancillary reagents that are not included with the test but are commonly used in clinical laboratories and are described in the authorized CDC 2019-nCoV Real-Time RT-PCR Diagnostic Panel Instructions for Use.

 

The CDC 2019-nCoV Real-Time RT-PCR Diagnostic Panel requires the following control

materials, or other authorized control materials; all controls listed below must generate expected results in order for a test to be considered valid, as outlined in the CDC 2019-nCoV Real-Time RT-PCR Diagnostic Panel Instructions for Use:

·   Human Specimen Control (HSC):  A human cell culture preparation used as an

extraction control and positive control for the RNase P primer and probe set that is
      extracted and tested concurrently with each specimen extraction run.
 ·   Positive Control for 2019-nCoV (nCoVPC):  Run with each batch of specimens.

Monitors for failures of rRT-PCR reagents and reaction conditions.

·   No Template Control (NTC):  Nuclease-free water included in each run.  Monitors for
      reagent and system contamination.

·   RNase P (RP) control in clinical samples:  The RP primer and probe set is included in
      each run to test for human RNase P, which controls for specimen quality and

demonstrates that nucleic acid was generated by the extraction process.

 

The above described CDC 2019-nCoV Real-Time RT-PCR Diagnostic Panel, when labeled
consistently with the labeling authorized by FDA, entitled “CDC 2019-Novel Coronavirus
(2019-nCoV) Real-Time RT-PCR Diagnostic Panel Instructions for Use” (available at

https://www.fda.gov/medical-devices/emergency-situations-medical-devices/emergency-use-

authorizations), which may be revised by CDC in consultation with, and with concurrence of, the
Division of Microbiology Devices (DMD)/Office of Health Technology 7 Office of In Vitro Diagnostics and Radiological Health (OHT7-OIR)/Office of Product Evaluation and Quality (OPEQ)/Center for Devices and Radiological Health (CDRH), is authorized to be distributed to and used by authorized laboratories under this EUA, despite the fact that it does not meet certain requirements otherwise required by applicable federal law.

 

The above-described CDC 2019-nCoV Real-Time RT-PCR Diagnostic Panel is authorized to be accompanied by the following information pertaining to the emergency use, which is required to be made available to healthcare providers and patients:

 

·   Fact Sheet for Healthcare Providers: CDC 2019-nCoV Real-Time RT-PCR
      Diagnostic Panel

 

附2:美国FDA紧急授权通知(机器翻译版)

2020年2月4日

罗伯特·雷德菲尔德，医学博士疾病控制和预防中心主任，

克利夫顿路1600号，MS D-14亚特兰大，乔治亚州30333

尊敬的博士：雷德菲尔德（Redfield）：这封信是应您的要求而答复的，美国食品药品管理局（FDA）为疾病控制与预防中心（CDC）颁发了紧急使用授权（EUA）2019-新型冠状病毒（2019-nCoV） -TimeReverse Transcriptase（RT）-PCR诊断小组，用于对上呼吸道和下呼吸道标本（例如鼻咽或口咽拭子，痰，下呼吸道吸出物，支气管肺泡灌洗液和鼻咽洗液/根据联邦食品，药品和化妆品法（该法）第564条（21 USC§360bbb-3），从符合CDC标准以进行2019-nCoV检测的个体中收集的吸出物或鼻吸出物）。测试仅限于CDC指定的合格实验室，并在美国根据美国1988年美国临床实验室改进修正案（CLIA）1988年认证。 §263a，以执行高复杂度测试。12020年2月4日，根据该法案第564（b）（1）（C）条，卫生与公共服务部（HHS）部长确定存在公共卫生根据该法令第564节的规定，HHS秘书随后宣布存在这种情况，这种紧急情况可能会影响国家安全或居住在国外的美国公民的健康和安全，并涉及2019-nCoV。证明可以紧急使用体外诊断法检测和/或诊断新型冠状病毒（2019-nCoV）的行为要符合该法令第564（a）条颁发的任何授权条款。2得出的结论是，根据第564条第（A）款颁发该授权的标准c）符合《法案》，我授权个人紧急使用CDC 2019-nCoV实时RT-PCR诊断面板（如本函件第二节所述） 1为便于参考，此信将提及“美国疾病预防控制中心指定的合格实验室，并在美国经1988年美国临床实验室改进修正案（CLIA）认证，美国42 §263a，作为“授权实验室”执行高复杂度测试”。2U.S。卫生与公共服务部，《公共卫生突发事件的确定》和``存在可以证明正当授权的情况的声明''，依据《美国联邦食品，药品和化妆品法》（美国联邦法典）第21条第564（b）节。 §360bbb-3。 2020年2月4日。

-疾病控制与预防中心的Redfield博士符合CDC的2019-nCoV检测标准，以经授权实验室推定2019-nCoV的检测，但要遵守本授权的条款。我已经得出结论，在符合CDC 2019-nCoV测试标准的个人中紧急使用CDC 2019-nCoV实时RT-PCR诊断小组符合该法案第564（c）节中颁发授权的标准，因为我已经得出结论那：1。 2019-nCoV可能会对感染该病毒的人类造成严重或威胁生命的疾病或状况，包括严重的呼吸道疾病; 2。根据FDA可获得的全部科学证据，有理由相信CDC 2019-nCoV实时RT-PCR诊断小组可以有效诊断2019-nCoV感染，并且CDC 2019-当用于诊断2019-nCoV感染时，nCoV实时RT-PCR诊断面板超过了此类产品的已知和潜在风险;和3。除了紧急使用CDC2019-nCoV实时RT-PCR诊断面板来诊断2019-nCoV感染外，没有足够的，认可的和可用的替代方法3.II.根据该法令第564（d）（1）条，我得出的结论是，本授权的范围仅限于授权实验室使用授权的CDC 2019-nCoV实时RT-PCR DiagnosticPanel进行推定检测2019-nCoVin符合CDC标准的2019-nCoV测试人员

 

授权CDC 2019-nCoV实时RT-PCR诊断试剂及方案

CDC 2019-nCoV实时RT-PCR诊断方案用于推定检测上下呼吸道标本中的2019-nCoV RNA（例如鼻咽或口咽拭子，痰，下呼吸道抽吸物，支气管肺泡灌洗液和鼻咽洗液/吸出物或鼻吸出物），以及其他符合CDC标准的2019-nCoV测试人员采集的样品。测试程序包括使用授权提取从人类标本中提取和纯化核酸方法/仪器，然后进行实时RT-PCR，其中RNA被反转录成cDNA，然后使用引物对进行扩增，并使用特异性探针进行检测。实时逆转录酶（RT-PCR在FDA批准的Applied Biosystems 7500 Fast上进行带有SDS 1.4软件的Dx实时PCR仪器或其他授权仪器软件。

CDC 2019-nCoV实时RT-PCR诊断方案包括以下材料或其他授权材料：

• 2019-nCoV_N1、2019-nCoV_N2和2019-nCoV_N3小瓶包含靶向核衣壳（N）基因, SARS样冠状病毒的检测以及2019-nCoV的特异性检测引物和探针.
• RP小瓶，其中包含针对人的内部对照引物和探针RNase P基因·
• nCoVPC小瓶包含用于分析的2019-nCoV阳性对照

CDC 2019-nCoV实时RT-PCR诊断方案还需要使用其他未包含在测试中但经过授权的授权材料和授权辅助试剂常用于临床实验室，并在CDC 2019-nCoV授权中进行了描述实时RT-PCR诊断面板使用说明。CDC 2019-nCoV实时RT-PCR诊断面板需要以下控制材料或其他授权的控制材料；下面列出的所有控件都必须产生预期的结果才能使测试被视为有效，如CDC 2019-nCoV实时概述中所述

RT-PCR诊断方案使用说明：

• 人体标本控制（HSC）：用作细胞培养的人类细胞培养制剂RNase P引物和探针组的提取对照和阳性对照在每次样品提取运行中同时进行提取和测试。
• 2019-nCoV（nCoVPC）的阳性对照：对每批样品进行分析。监视rRT-PCR试剂的失败和反应条件。
• 无模板对照（NTC）：每次运行均包含无核酸酶的水。监控试剂和系统污染。
• 临床样品中的RNase P（RP）对照：RP引物和探针组包含在每次运行都要测试人RNase P，以控制样品质量和证明核酸是通过提取过程生成的。

上面标记的CDC 2019-nCoV实时RT-PCR诊断方案与FDA授权的标签一致，标题为“ CDC 2019-Novel Coronavirus”（2019-nCoV）实时RT-PCR诊断方案使用说明”（可从以下网站获得）https://www.fda.gov/medical-devices/emergency-situations-medical-devices/emergency-useauthorizations. 

附3

微量总 RNA 提取试剂盒及方法, 根据Huang C 等(Lancet. 2020 Jan 24) 方法改编

微量总 RNA 提取试剂盒(另需购买本公司TRIZOL裂解试剂)

Catalog No. TR206-50 (50 次反应) 或TR206-200 (200 次反应)

TRIZOL等类似试剂裂解

试剂盒组成: 洗涤液 1, 第一次使用前按说明加指定量乙醇 (无水乙醇, 95-100%）;RNA 洗涤液 2, 第一次使用前按说明加指定量乙醇; RNase-free H2O 室温 6 ml; 1 号柱, 收集管（2ml）

特性:

1. 样品来源：TRIZOL等类似试剂裂解的样品。

2. 样品范围：≥17核苷酸。

3. RNA纯度：高质量的RNA可应用于高通量测序等敏感的下游实验。

 4. RNA结合量：每个柱子可最多结合10μg的RNA。

操作步骤:

以下离心力如无特殊说明均在10,000-16,000 x g范围内离心1分钟。

（I） 样品裂解匀浆 此步骤主要参考TRIZOL等类似裂解试剂说明书的裂解液用量，以下给出我公司提供的可完美替换 TRIZOL的TRIcom试剂用量作为参考

1)全血样品：直接取1体积的液体样品，加入3 倍体积裂解液（推荐100μl全血加入300μl以内），充分振荡并 且混匀。

2) 洗鼻液，漱口液离心弃上清，细胞沉淀加300μlTRIZOL裂解液.

（ I I）样品纯化：

1. 加入等体积(95-100%)的无水乙醇到上一步TRIcom或TRIZOL裂解液中混匀。

 2. 将上述混合物放入套在收集管内的1号柱里，离心1分钟。去除滤出液。

 3.添加400μl的RNA洗涤液2到1号柱里，离心1分钟。去除滤出液。

 4. 添加400μl的RNA洗涤液1到1号柱子里，离心1分钟。去除滤出液。

 5. 添加700μl的RNA洗涤液2到1号柱子里，离心2分钟以免洗涤液残留。

6. 取出1号柱，放入一个无RNA酶的离心管中，在吸附膜的中间部位加10-15μl RNase-free water（事先在 65-70℃ 水浴中加热效果更好）， 室温放置2分钟， 离心1分钟洗脱RNA。

(北京天漠科技开发有限公司 Tel: [phone] · Web: www. tianmobio.com)