根据美国获得的文件，美国科学家计划与武汉病毒研究所合作，在病毒从该市出现的前一年设计出具有 SARS-CoV-2 特征的新型冠状病毒。知情权。
这些文件显示，虽然这些特征在自然界中很少见，但这些特征是与武汉实验室合作的科学家们深奥研究兴趣的核心。
多年来，科学家们对所谓的“实验室泄漏”和自然起源假说存在分歧，多年来一直在研究一项名为“DEFUSE”的美中研究提案中描述冠状病毒工程实验的晦涩难懂的语言。
DEFUSE 赠款提案由 EcoHealth Alliance 主席 Peter Daszak 领导。
现在，通过《信息自由法》（Freedom of Information Act）发现的草稿和笔记揭示了有关预期研究的新细节。
具体来说，科学家们试图在刺突蛋白的 S1/S2 连接处插入弗林蛋白酶切割位点;将合成病毒组装成六个片段;识别与 SARS 差异高达 25% 的冠状病毒;并选择擅长感染人类受体的受体结合结构域。
SARS-CoV-2（导致 COVID-19 的病毒）的基因组与研究提案中描述的病毒相匹配：
- SARS-CoV-2 在 S1/S2 连接的刺突蛋白中有一个 furin 切割位点。弗林蛋白酶切割位点使病毒成为一个世纪以来最严重的大流行病原体。病毒学家尚未在任何其他相关冠状病毒中发现一个。
- SARS-CoV-2 可被限制性内切酶 Bsal 和 BsmBI 分成六个连续的基因组片段。这些限制性内切酶存在于自然界中，但也可以在实验室中用于剪接病毒。三位科学家在 2022 年的一项分析中估计，在自然界中看到 SARS-CoV-2 模式的可能性很小。其中一种限制性内切酶 BsmBI 的订单可在文档中找到。
- SARS-CoV-2 具有高度传染性，在人类中没有发生太大进化。病毒“开箱即用，准备感染”。受体结合结构域似乎对人类 ACE2 受体进行了“微调”，但在首次溢出到人类体内时几乎没有遗传变异，这给试图证明它是自然出现的病毒学家提出了一个困难的“悖论”。这些文件证实，与武汉实验室合作的科学家在他们的研究中试图选择与人类 ACE2 结合良好的受体结合结构域。
- SARS-CoV-2 的基因组与 SARS 的遗传差异在 25% 的范围内。
这些文件首次显示，与武汉实验室合作的病毒学家计划设计新的刺突蛋白——这与该合作将整个刺突蛋白插入病毒骨架的公开工作形成鲜明对比。提案中的语言表明，这项工作可能涉及未发表的病毒，产生了未发表的工程刺突蛋白。
这位美国病毒学家，北卡罗来纳大学教授 Ralph Baric 被安排每年设计 20 个或更多“嵌合”SARS 相关病毒刺突蛋白，以及 2 到 5 个全长工程 SARS 相关病毒。美国之前报告的文件知情权表明，一些实验可能在武汉秘密进行，生物安全水平低于赠款中规定的水平，显然是为了节省成本。
这些文件挑战了美国国立卫生研究院（National Institutes of Health）和一些病毒学家提出的论点，反对该研究提案与大流行起源的相关性。他们认为，这项美中科学合作只是计划从公共文献中已有的病毒骨架开始设计病毒，而这些病毒骨架太不同了，不可能在大流行中发挥作用。
然而，新文件显示，科学家们计划使用新的反向遗传学系统并在体内测试病毒——换句话说，设计具有新骨架的活病毒。
这些文件将资助中要研究的 SARS 相关病毒描述为构成“类似 SARS 的新大流行的明显和现实的危险”。
这些文件并未证明 SARS-CoV-2 是如何在实验室中产生的精确分步说明手册。科学家们计划研究的一些 SARS 相关病毒的基因组仍然未知。但他们确实描述了可能产生病毒稀有特性的实验。他们详细介绍了科学家对研究 SARS-CoV-2 等病毒的兴趣。
该资助提案已提交给国防高级研究计划局，但该局拒绝了该项目。该研究是否通过其他方式获得资助仍不得而知。在提交提案时，Baric 已经设计了未知的刺突蛋白。
尽管如此，这些文件表明，一个世纪以来最严重大流行的一些核心数据可能不仅在中国找到，而且在美国也可以找到。
“当武汉病毒研究所发表他们的第一篇关于大流行病毒的论文时，他们没有提到独特的弗林蛋白酶切割位点，尽管他们最近撰写了 DEFUSE，宣称他们正在寻找新型 SARS 样病毒中的这些令人担忧的特征，”博德研究所分子生物学家 Alina Chan 说。“我们需要在 2018 年，尤其是 2019 年——大流行之年——进行武汉病毒研究所与其美国合作者之间的所有交流。”
S1/S2 边界的 Furin 切割位点
虽然正式的 DEFUSE 提案的语言要求在称为“S2”的刺突蛋白部分插入“人类特异性蛋白水解切割位点”，但 DEFUSE 的早期草案更为明确。
蛋白水解切割位点是比 Furin 切割位点更通用的术语。它指的是允许酶切割刺突蛋白的氨基酸组合，这有助于 SARS-CoV-2 等病毒进入人体细胞。但蛋白水解切割位点可以被多种酶激活，而不仅仅是弗林蛋白酶。
最终正式提案中的这一措辞一直是 DEFUSE 文件辩论的一个症结所在。
斯克里普斯研究所病毒学家克里斯蒂安·安德森 （Kristian Andersen） 是自然起源理论的倡导者，他认为 DEFUSE 与 COVID 的起源几乎没有关系，因为该赠款要求在刺突蛋白的 S2' 位置引入蛋白水解切割位点。
然而，早期的草稿表明科学家对 Furin 切割位点特别感兴趣。这些文件表明，科学家们还不确定其他卵裂位点的相对重要性。
早期的草稿还精确地指定了预期插入的位置，包括与 S1/S2 结相对应的插入位置，而不仅仅是在 S2′ 处。
“组织培养适应有时会引入一个弗林蛋白酶切割位点，该位点可以指导进入过程，通常是通过切割其他冠状病毒（而不是 SARS）的 S757′ 中 900 和 2 位的 S，”赠款中写道。
位置 900 是 S2′ 位点，位置 757 是 S1/S2 位点。
对该提案的评论澄清说，该语言引用了 Baric 的“图 C”。
图 C 显示了 S1/S2 边界的弗林蛋白酶切割位点，正是 SARS-CoV-2 中弗林蛋白酶切割位点的位置。
一些科学家说，这些文件表明，该研究小组已经找到了一种用切割位点分离或插入SARS相关冠状病毒的方法。
限制性位点
一些支持自然起源理论的科学家认为，武汉实验室只会在已发表的文献中采用熟悉的骨架，并换掉刺突蛋白。由于已发表文献中的这些骨架在基因上太过相似，以至于无法产生 SARS-CoV-2，因此他们认为 DEFUSE 提案与大流行无关。
然而，更坦率的资助早期草案显示，研究人员计划在这些熟悉的骨架中测试工程刺突蛋白，作为初步测试，这将帮助他们为下一步确定基因组的优先级：生成六部分合成病毒。
该小组以这种方式确定的具有“流行前潜力”的刺突蛋白将用于下一步，即产生“全基因组长度的活病毒”。
文件显示，DEFUSE 背后的科学家提出了一种策略，使用六个片段将与 SARS 相关的病毒基因组拼接在一起。
他们计划组装全长合成病毒。这些病毒将从共有序列组装而成，共有序列是一组密切相关病毒中最常见的碱基对的序列。
这些病毒彼此之间可能有高达 5% 的核苷酸差异。RaTG13 是 SARS-CoV-2 最接近的表亲病毒之一，由武汉病毒研究所测序，与 SARS-CoV-2 相差 4%。
“我们将确定最佳的共识候选者，并使用商业供应商（例如 BioBasic 等）合成基因组，作为六个连续的 cDNA 片段，这些片段由独特的限制性核酸内切酶位点连接，这些位点不会干扰编码序列，但允许全长基因组组装，”该资助指出。
文件显示，他们预计合成病毒会很便宜。
研究人员计划用这些全长合成病毒感染具有人源化肺细胞的小鼠。
新披露文件中的这种语言与 2022 年的一项分析相呼应，该分析揭示了两种限制性内切酶 BsmBI 和 BasI 的模式，它们将 SARS-CoV-2 病毒基因组分割成六个偶数片段。科学家们估计，在自然界中观察到这种均匀分布的片段模式的可能性是极不可能的。
当时，它被 Andersen 斥为“幼儿园分子生物学”。
“许多病毒学家说我们的分析是有缺陷的，声称目的一定是替换整个刺突......或者几乎可以在任何冠状病毒基因组中找到类似的模式，“该分析的合著者、维尔茨堡大学分子免疫学家瓦伦丁·布鲁特尔 （Valentin Bruttel） 说。“正如我们假设的那样，他们计划使用 6 个片段来组装合成病毒。”
新披露的文件还包括 New England Biolabs 对 BsmBI 的订单，BsmBI 是这些关键的限制性内切酶之一。他们还计划购买其他未指定的限制性内切酶。New England Biolabs 还销售 BsaI 限制性内切酶，以及数百种其他内切酶。
在订购 U.S. 获得的文件时知情权，此预算表紧跟在一封电子邮件之后，该项目的 USGS 合作者 Tonie Rocke 在电子邮件中表示已附上她的预算。虽然 Rocke 准备与 Baric 合作，但目前尚不清楚她是否是这项基因工程工作的核心。
尽管如此，一些科学家表示，这一发现类似于支持实验室假说的“冒烟的枪”。
但这一发现可能会引发争论。
在自然界中与 SARS-CoV-2 密切相关的病毒中，已经发现了一些在 SARS-CoV-2 中被鉴定为可能信号的限制性内切酶位点，这表明它们可能是重组的结果，而不是工程的结果。
受体结合结构域
与 DEFUSE 提案相关的电话新获得的笔记显示，该研究小组对 SARS 相关冠状病毒感兴趣，这些冠状病毒在病毒基因组的关键部分（受体结合域）中类似于 SARS-CoV-2。
Baric 计划通过寻找擅长附着在人类 ACE2 受体上的切割位点和受体结合结构域来筛选具有流行潜力的受体结合结构域。
除了弗林蛋白酶切割位点之外，SARS-CoV-2 几乎能够立即在人类中传播而无需太多进化——事实上它“适应得很好”——自大流行最初几个月以来，它一直是可能实验室起源的危险信号。
这些说明还显示，Baric 设计了未出现在公共科学文献中的刺突蛋白，并且在提案提交给 DARPA 时，这项工作可能已经在进行中。
“RB [Ralph Baric] 已经从一组名为 293（对于 S1）的蝙蝠病毒中产生了带有 RBD [受体结合域] 的 SARS 样嵌合体，这与流行菌株不同 20%，S2 区域与 HK3 不同，差异 20%，”笔记中写道，显然指的是由两种不同蝙蝠病毒株产生的工程刺突蛋白。
虽然 HKU3 蝙蝠病毒是已知的，但“称为 293 的蝙蝠病毒”的说法是模棱两可的，并且似乎不是指任何公共病毒群。
WIV 的新型病毒
在提交资助提案时，武汉实验室采样的许多病毒没有进行传播性或致病性评估。他们的基因组可能不公开。
“武汉病毒研究所团队将继续收集中国各地蝙蝠洞的 SARSr-CoV 病毒的生物多样性调查，”文件写道。“他们有大量但不完整的 SARSr-CoVs 序列集合，其中大多数尚未评估流行前的潜力。”
该资助提案的早期版本指出，武汉病毒研究所高级科学家石正丽的实验室正在进行实验测试，尽管这最终对 DARPA 隐瞒了。
文件显示，该研究小组除了在中国南方更广为人知的采样工作外，还在老挝有一个蝙蝠病毒采样热点。
科学家们还将他们的研究目标描述为包括保护驻扎在东南亚的美国士兵。在老挝发现了一些与 SARS-CoV-2 最接近的表亲病毒，包括一种名为 Banal-20-52 的病毒。
