《铁道游击队》在1966年5月就成为首批被“无产阶级司令部”点名批判的电影之一。
小说作者刘知侠被关入“牛棚”。仅1966年7月22日、26日、28日和8月4日这4天的《大众日报》，都在 “彻底揭露和批判刘知侠的反党反社会主义罪行”的通栏标题下发表整版的“大批判”文章。
几个月后，“文革”公开打倒刘少奇，刘知侠罪加一等。因为《铁道游击队》第27章“掩护过路”，详尽描写了铁道游击队掩护胡服 （刘少奇的化名）过陇海铁路、到延安开“七大”的历史事实。在“牛棚”的囚禁中，他遭到非人的磨难，在一个初春的深夜，他撕破床单，结成布绳，拴在窗口上，从3层楼上逃了出来，跑到市郊的“芳林嫂”的原型刘桂清家。“芳林嫂”冒着风险掩护了他4个多月，为他养好了伤口。面对贴在门前的刘知侠通缉令和一次次搜索，她临危不惧，几次机智地将刘知侠转移到儿女们和朋友的住处，使他安全度过最危险时刻，保住了生命。
在长达10年的时间里，他被剥夺了写作的权利，被批斗、游街、劳改，身心受到空前摧残。
1977年9月，上海人民出版社准备再版《铁道游击队》，此时“文革”虽已结束但并未被否定，刘少奇还未平反，所以出版社提出必须将原著第27章中关于刘少奇的有关段落完全删掉，迫于当时的形势，也为了能够再版，刘知侠只得忍痛违心答应；而且，这一版的扉页印上了一段黑体字的“毛主席语录”：“整个游击战争，在敌人后方所起的削弱敌人、钳制敌人、妨碍敌人运输的作用，和给予全国正规军和全国人民精神上的鼓励等等，都是战略上配合了正规战争。”
电影《铁道游击队》中政委李正的扮演者、也是电影《南征北战》中为人熟知的高营长扮演者、著名演员冯喆在文革中于1969年被迫害致死，年仅48岁。一说他是在“牛棚”中不堪折磨悬梁自尽；一说他是在“牛棚”被“专政者”打死后被伪造成悬梁自尽 。
插曲《弹起我心爱的土琵琶》开始被批为“很不健康”、“格调低下”，后来逐步升级为“反动”：“革命人民”大唱“东方红，太阳升”歌颂伟大领袖毛主席的时候，但这首插曲第一句却是“西边的太阳快要落山了”，是“别有用心”，将毛主席比为“快要落山”的“西边的太阳”，“是可忍，孰不可忍？”因此罪加一等：“用低俗的歌曲恶毒攻击伟大领袖毛主席”，“反动之极”！
