我对屠呦呦说法的一点点疑惑
在多位网友的良好建议下，现补充一个摘要：
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我对屠呦呦以下这个经典说法有些疑问：
研究受挫之后，屠呦呦从《肘后备急方》中青蒿“绞汁”治疗疟疾的描述获得灵感，认识到高温煎煮破坏了有效成分（1），从而不用乙醇改用沸点较低的乙醚提取（2），该提取物在鼠疟模型上取得了100%的抑制率（3），终于获得目前最好的抗疟药青蒿素。
我的疑问是：
（1)现有证据表明，黄花蒿的水煎剂是有临床疗效的。artemisinin降解是与温度和时间相关的。所谓温度并不是一个决定性因素。
（2）现有数据表明（推论），用乙醇从Artemisia annua提取Artemisinin，在其粗体物中，是可以含有稳定的artemisinin的。这说明，将溶剂由乙醇换成乙醚，不是一个关键的因素。
（3）现有数据表明，某些不含有artemisinin的蒿类在鼠疟模型上也可以获得非常高的抑制效果（94-98%）。因而鼠疟模型上的高抑制率并不能100%的导出含有Artemisinin的结论。
（4）在我的逻辑看来，即使从葛洪的青蒿治疗疟疾获得启发，更为重要的是确定他描述的“青蒿”是什么？而当时，至少是有2个法定的植物来源。而屠呦呦没有对当时可能更为正统的来源植物青蒿（Artemisia apiacea Hance）有过具体的说明。这是我不能理解的。
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我对屠呦呦说法的一点点疑惑 by Pursat
其实，前年我就想写这篇文章了。当时我还找我喜欢的一位专门搞医学史的教授深入讨论过。教授也鼓励我写出来。可是我还是拖拖拉拉，收集的资料遗落在硬盘的一个角落，一直没有动笔。
突然获知屠呦呦获得Lasker临床医学奖，再看了获奖介绍和Cell上面对青蒿素发现史的介绍后，再次点燃了我的疑惑。屠呦呦讲了多年的一个“美好”的故事，终于（竟然）上到国际舞台了。这个故事容易让人产生“美丽的野蛮人”印象，因而更容易诱惑人。我没有能够看到更多的青蒿素研究原始资料，仅就发表的一些研究论文给我带来的疑惑表达出来，顺便做一点青蒿素和疟疾的科普。
研究受挫之后，屠呦呦从《肘后备急方》中青蒿“绞汁”治疗疟疾的描述获得灵感，认识到高温煎煮破坏了有效成分，从而不用乙醇改用沸点较低的乙醚提取，该提取物在鼠疟模型上取得了100%的抑制率，终于获得目前最好的抗疟药青蒿素。在读书期间，我就熟知这个故事了，也因此对屠呦呦非常敬佩，直到有一天。
有一天，我在查找青蒿素或者疟疾的论文的时候，在Pubmed看到一篇摘要，一个老外用传统的中药煎煮法（traditional tea preparations）做临床试验，测试Artemisia annua(黄花蒿)对恶性疟疾的临床疗效。当时，我对自己说，这个傻老外，真是不懂中文吃亏啊，中国科学家在70年代发现青蒿素的时候就知道青蒿一煮，青蒿素就分解了哈，就没有效了，再说青蒿素在水中几乎不溶嘛。不过，我还是顺便打开全文看了。该临床试验结果与我既往的认识很不一样，给我一个很大的冲击。于是我顺藤摸瓜，得到下面的线条，各位看官看好了。
关于温度，Artemisia annua黄花蒿的水煎剂真的没效么？
德国LUTZ HEIDE的研究组，在研究Artemisia annua(黄花蒿)传统煎煮方法口服后青蒿素药代动力学的摘要中写道【1】：
Artemisia annua(黄花蒿)含有抗疟药青蒿素。干燥Artemisia annua的水煎剂用来治疗发热和疟疾记录在中华人民共和国药典上（看到这句我真想笑哈。咱中国人有人把这个当真么？貌似屠呦呦对咱中华人民共和国药典就不太上心。这个稍后再说）
14名健康男性志愿者服用了9克Artemisia annua叶子泡的茶水1升（两瓶矿泉水的量，貌似15分钟内喝完如果不太渴的话可能会有点撑）。作者测定了这9克叶子用开水泡出来的茶含有94.5mg的青蒿素哦。青蒿素的最大血药浓度均值为240+/-75 ng/mL。这个浓度是体外试验中恶性疟原虫青蒿素最小抑制浓度（9ng/ml）的26倍【2】。
不同的煎煮方法，5克或9克（之所以选这个剂量，是应为中国人民共和国药典上的用量为4.5-9克！）干叶子获得的青蒿素量是不同的，在36.5-94.5mg/L之间。（一位叫Jansen的研究者对此有疑问，因为他用Artemisia水煎剂，只获得24.2 mg/L青蒿素【2】。但是在我看来，煎煮法依然可以获得相当量的青蒿素。24和94之间，仅仅是数倍的差别，这与我们“常规”认识的“1或者0”是有天壤之别的！）
Lutz Heide检测了不同的煎煮方法获得青蒿素含量的区别。让我们看提取效率最低的一组：一升开水加入到9克干叶子，继续煮沸30分钟，室温下冷却再过滤，依然获得了37.8mg/L的青蒿素，提取效率依然有30%【1】。
从Artemisia annua干叶子中提取青蒿素，分析植物中青蒿素含量的方法，作者利于Zhao SS, Zeng MY的方法进行了改进，即1g粉碎的干叶子用Soxhlet 提取仪在100ml石油醚60-90摄氏度提取3个小时。溶剂蒸发后残余物溶于10.0mL乙醇，用HPLC检测。检测出该改良的Artemisia annua干叶子中青蒿素含量为1.39%。（60-90摄氏度三个小时哦！不担心青蒿素降解吗？！）
从这个小研究中，我们可以得知：
1. Artemisia Annua（黄花蒿）即使煎煮30分钟，其水煎剂的青蒿素的提取效率依然有30%。
2. 健康受试者服用9克Artemisia annua干叶子的水煎剂1升后相当于服用了94.5mg青蒿素，其青蒿素最高血药浓度可达240+/-75 ng/mL，是体外最小抑制浓度（9ng/ml）的26倍，足够产生临床效果了。
该研究组于是在2001年在民主刚果开展了临床试验，一个随机对照临床试验来评估Artemisia annua传统煎剂对无并发症恶性疟疾的疗效和安全性。无并发症恶性疟疾患者一组接受Artemisia annua传统煎煮法治疗（5g或者9克）【3】，一组接受奎宁治疗。
1L的Artemisa annua水煎剂分4此服用：早上，中午，16:00, 20:00;连续服用7天。
喹啉为每次500mg口服，每日三次，连服7天。
结果如下。
从症状缓解来说，水煎剂组和奎宁相似。第7天原虫转阴的情况为水煎剂组70-77%，奎宁组为91%。虽然水煎剂组复燃率高，但是35天的治愈率也有30-34%。这主要是5-9 克Artemisia annua干叶子水煎剂中青蒿素的量仅为94mg，且分为一天4次服用，仅为临床上青蒿素一般用量500mg/天的19%。
在2002-2003年，该研究组又在坦桑尼亚开展了一项随机双盲临床试验来评估Artemisia annua水煎剂对于恶性疟疾的疗效和安全性【4】。
一组服用5g/9g Artemisia annua干叶子的1升水煎剂，每天一升水煎剂，连服7天；一组服用SP（磺胺多辛-乙胺嘧啶）。用安慰剂平衡两组，就可以做到双盲了。因为两组的复燃率都很高，因而提早结束了试验。第7天的结果为7/10(水煎剂) vs 7/9（SP）;第14天的结果为4/10 vs 4/9; 第28天的结果为1/9 vs 3/8.
该德国研究组开展的artemisia annua(黄花蒿)水煎剂健康受试者药代动力学研究以及在刚果和坦桑尼亚开展的2个随机对照临床研究清楚表明，青蒿素的水煎剂对于恶性疟疾是有临床作用的，能够缓解和清除临床症状，抑制/杀灭恶性疟原虫，尽管复燃率高。
所以我的疑问之一是，所谓高温提取破坏了青蒿素。对于早期探索阶段这个因素似乎不那么重要，因为即使沸水煎煮30分钟，水煎剂的提取率仍然有30%嘛。这和99%的提取率也仅是3倍的差距嘛。该研究组的临床试验中仅用了5-9克的黄花蒿，就可以取得明显的临床疗效。而屠呦呦的临床试验中粗提物的用量达到3g，BID或TID连服3天，临床疗效却很不理想。为什么？给我一个合理的解释？
而且，该研究组分析干叶子青蒿素含量的方法用的是Soxhlet 提取仪在100ml石油醚60-90摄氏度提取3个小时。60-90摄氏度3个小时哦。95的乙醇，其沸点是多少？什么？78.1摄氏度？青蒿素在这个温度下都分解了么？！于是产生了我第二个疑问。
2. 将提取剂乙醇换成低沸点的乙醚对于粗提物中是否能含有一定量的青蒿素有那么重要么？
青蒿素是溶于乙醇的。这点没有问题。屠呦呦的说法是，用乙醇提取不能获得青蒿素（或者说不能稳定获得青蒿素），是因为温度太高，青蒿素都降解了。
于是，我找啊找，找到了一篇几乎和我意的论文：“Solubility of Artemisinin in Ethanol + Water from (278.2 to 343.2) K”,是浙江大学做的【5】。这项工作太基础了。感谢你们发表出来哈。
Yi-Yu Cheng在该研究中发现，青蒿素在343.2K（即70摄氏度）中2小时后有轻微的（slightly）降解(it was noticed that artemisinin decomposed slightly in the solution at 343.2 K after 2 h), 于是70摄氏度以上的溶解度数据就没有测定了（从我现在想探究青蒿素最初发现历史的角度来说，缺乏后面的数据太可惜了）。该研究表明，在乙醇和水的体系中，青蒿素的溶解度随着乙醇浓度的升高而升高，随着温度的升高而升高（他们还给出了一个高精确度的方程）。在纯乙醇70摄氏度时，青蒿素的溶解度为0.01588（摩尔比率溶解度）。
对于青蒿素发现史，我从该文章的获得的解读是，以乙醇为溶剂，完全可以从Artemisia annua中获得具有稳定青蒿素含量的粗提物。乙醚的作用有那么大么？即便考虑到温度因素，也完全可以控制温度用乙醇来提取嘛，有必要把溶剂非得换成乙醚么？
3. “屠呦呦的1971年10月4日：让我们记住这一天
在这一天，屠呦呦小组第一次成功地用沸点较低的乙醚制取青蒿提取物，并在实验室中观察到这种提取物对疟原虫的抑制率达到了100%。”【6】
我的疑问是，提取物在鼠疟模型中获得100%的抑制率，这提取物里就一定含有青蒿素么？
在中国发现青蒿素之后，其他国家的研究人员也研究了当地的蒿属植物（Artemisia）的抗疟作用。其中，墨西哥和伊朗的学者发表了我所期待的文章。呵呵
墨西哥研究者1997在Parassitologia期刊中的研究论文称，当地的Artemisia ludoviciana的乙醇提取物在感染Plasmodium yoelii的鼠疟模型上获得了98.6%的疟原虫抑制率。ED50为29.2 mg/kg。但是他们在乙醇提取物中未能找到青蒿素【7】。
伊朗学者在2010年在Parasitol Res上发表了他们对本地蒿属植物抗疟性的研究【8】。干燥的植物用80%的乙醇提取，研究总提取物的抗疟活性以及用TLC，HPLC，1H-NMR技术来检测青蒿素。5种被研究的伊朗本地蒿属植物中有两种对多重耐药的恶性疟原虫表现出良好的抗疟活性。A. absinthium和A. Annua在200 mg/kg 4天的疗程下，对于Plasmodium bergei感染的BALB/C小鼠，其疟原虫抑制率分别为94.28%和83.28%。但是研究人员在所有被研究的5中蒿属植物中都没有检测到青蒿素。作者认为，这种蒿属植物的抗疟性能很可能与提取物中高浓度的精油（essential oils）相关。 这两项研究表明，即使完全不含有青蒿素，某些蒿类植物的乙醇提取物依然可以获得非常高的抗鼠疟活性（83-94-98%）。
4. 可是我还是有疑问。于是我也去翻葵花宝典。李时珍的《本草纲目》（1596年）清楚的记载了青蒿和黄花蒿两个条目；青蒿之后紧接着就是黄花蒿的条目。黄花蒿的条目较短，可以录在这里【9】。
黄花蒿（纲目）
『释名』臭蒿。
『集解』【大明约】臭蒿一名草蒿。『时珍曰』香蒿臭蒿通可名草蒿。此蒿与青蒿相似，但此蒿色绿带淡黄，气辛臭不可食，人家采一罨酱黄酒曲是也。
叶
[气味]辛，苦，凉，无毒。
[主治]小儿风寒惊热。时珍。
如果我做研究，我想，我应该首先弄清楚这里记载的青蒿和黄花蒿都是什么？
有两个比较权威的工具书可供参考先，一个是《中国植物志》，一个是《中华人民共和国药典（一部）》。
植物分类学家在《中国植物志》上，是这样记录的【10】（我查询的是2009年获得国家自然科学一等奖之后的电子版）：39.青蒿 Artemisia carvifolia, A. apiacea Hance。作者比较了这个两个拉丁名植物的模式标本，“发现二者体态、叶、头状花序等特征无异，故后者为晚出异名，应予以归并”。“《本草纲目》等古本草记述的“青蒿花色淡青，淡黄色”者可能是本种。”“本种不含“青蒿素”，无抗疟作用。” 40. 黄花蒿 Artemisia annua L. “古本草书记述的“草蒿”（神农本草经）及“青蒿”（除花色淡青、淡黄色者外）与“黄花蒿”（本草纲目）无异，中药习称“青蒿”，而植物新通称为“黄花蒿”A. annua。
《中华人民共和国药典（一部）》对于中药青蒿几经调整【11】。
1953年版及其增补版中华人民共和国药典，都仅有一册，没有专门收入中药。
1963年版中华人民共和国药典分为两部，一部为中药，二部为西药。其一部对中药青蒿的规定为：“本品为菊科（Compositae）植物青蒿（Artemisia apiacea Hance）或黄花蒿（Artemisia annual L.）的干燥茎叶。”，这是前Artemisinin时代。
1977年《中华人民共和国药典（第一部）》对中药青蒿的描述为“本品为菊科植物黄花蒿Artemisia annua L. 或青蒿Artemisia apiacea Hance的干燥地上部分。”这已经是后Artemisinin时代。中药青蒿的来源中黄花蒿和青蒿与前一版药典中的顺序调了一下位置。
到2005年版《中华人民共和国药典（第一部）》，中药青蒿的描述就成了“本品为菊科植物黄花蒿Artemisia annua L.的干燥地上部分”。植物青蒿被从中药青蒿中除名了！
屠呦呦在其叙述中，一开始就是叫青蒿，提取的结晶叫青蒿素I和青蒿素II【12】【13】。她也没有主动介绍过其提取原料-中药青蒿的植物来源。她的英文文章中，一上来就说Artemisia annua。
我疑惑的是，在天子脚下的中医研究院工作，难道一点都不重视中华人民共和国法定的中药药典么？当时的药典对于中药青蒿的来源，明明有2个植物来源嘛。为什么在屠呦呦的论述中一直就没有区分这两种植物，只是在artemisinin明了之后，屠呦呦突然很有了很强的植物分类研究的兴趣，强行论证Artemisia annua即植物青蒿【12】,是中药青蒿的正品，黄花蒿是青蒿的异名。我不明白哈。在早期探索研究中，artemisinin还不知为何物的情况下，她是如何认定李时珍对青蒿的描述就是Artemisia annua。根据《中国植物志》，即使在artemisinin大白天下的今天，中国的植物分类学家依然认为李时珍在《本草纲目》中描述的青蒿可能包含2种植物，一些是属于Artemisia apiacea Hance的形状状，一些是属于Artemisia annua的性状。仅仅凭葛洪的一句青蒿一握可止疟，我们并不能判断出葛洪的青蒿到底是那种植物。为什么屠呦呦没有讨论本草纲目中青蒿条目下描述下可能存在的2种植物，而直接就先知先觉的认定就是拉丁名所说的Artemisia annua呢？为什么完全忽略现代植物学分类学家的贡献？而且当时法定的药典中，Artemesia apiacea Hance排在Artemisia annua之前哈。您如何不做两者的分析，就直接将Artemisia apiacea Hance出局了呢？（确定一个植物，我想首先且最重要的一点是它的植物形状。它的药理活性，我想应该不是确定植物种属的一个先决条件。现在大家都在改良Artemisia annua，希望获得更高青蒿素含量的品种。如果我逆着这个方向改良，获得一个品种完全不含artemisinin。或者本来世界各地的Artemisia annua的青蒿素含量就相差巨大，对于那些天然不含artemisinin的Artemisia annua不知道在屠奶奶的眼里，它到底还是不是artemisia annua了？）
如果有时光倒流机器，将墨西哥和伊朗学者对蒿类抗疟疾研究发表在1960年代末，且发表在中国期刊上，或者干脆他们作为洋千人直接在523项目的会议中秘密报告了鼓舞人的试验结果，仅隐藏未找到artemisinin这一点。他们会取代屠呦呦现在的地位嘛?如果墨西哥人和伊朗人也学会了《大红灯笼高高挂》【14】中的技术，一直咬定自己提取出了青蒿素，而他人按照这些洋千人研究的提示，果然在Artemisia annua中找到了Artemisinin。洋千人们是否会在这乌龙中中得一个大奖？尽管这种假设很无聊，但是很遗憾，逻辑上它是自洽的。
她所讲的这个貌似美丽的故事，给我带来不少的误导。因为逻辑上，屠呦呦的成果不能与墨西哥和伊朗的研究者区分开来：他们都发现一些蒿类植物在鼠疟模型上体现了高效的抗疟活性，但是很遗憾，这些蒿类植物中并不含有artemisinin。如果还有更大型的奖项颁给屠呦呦，希望能够讲一个让我能明白的故事。谢谢！
【1】 KARIN R?TH, KATJA TAXIS, GITTA WALZ, CHRISTOPH H. GLEITER, SHU-MING LI, AND LUTZ HEIDE. PHARMACOKINETIC STUDY OF ARTEMISININ AFTER ORAL INTAKE OF A TRADITIONAL PREPARATION OF ARTEMISIA ANNUA L. (ANNUAL WORMWOOD). Am. J. Trop. Med. Hyg., 70(2), 2004, pp. 128–132. 【2】 L. Heide. Artemisinin in traditional tea preparations of Artemisia annua. Transactions of the Royal Society of Tropical Medicine and Hygiene (2006) 100, 802 【3】 Markus S. Muellera,, Nyabuhanga Runyambo, Irmela Wagner,Steffen Borrmann, Klaus Dietz, Lutz Heide. Randomized controlled trial of a traditional preparation of Artemisia annua L. (Annual Wormwood) in the treatment of malaria . Transactions of the Royal Society of Tropical Medicine and Hygiene (2004) 98, 318—321 【4】 Christoph H Blanke, Godson B Naisabha, Mussa B Balema, Godfrey M Mbaruku, Lutz Heide, Markus S Mu¨ ll. Herba Artemisiae annuae tea preparation compared to sulfadoxinepyrimethamine in the treatment of uncomplicated falciparum malaria in adults: a randomized double-blind clinical trial. Tropical Doctor April 2008, 38. 【5】 Long-Hu Wang, Yan-Ting Song, Yong Chen, and Yi-Yu Cheng. Solubility of Artemisinin in Ethanol + Water from (278.2 to 343.2) K. J. Chem. Eng. Data 2007, 52, 757-758. 【6】 傅新元. 屠呦呦的1971年10月4日：让我们记住这一天. http://group.sciencenet.cn/home.php?mod=space&uid=453765&do=blog&id=488108&page=2 【7】 Malagón F,.Vázquez J, Delgado G, Ruiz A. Antimalaric effect of an alcoholic extract of Artemisia ludoviciana mexicana in a rodent malaria model. Parassitologia. 1997 Mar;39(1):3-7 【8】Ali Ramazani & Soroush Sardari & Sedigheh Zakeri & Behrouz Vaziri. In vitro antiplasmodial and phytochemical study of five Artemisia species from Iran and in vivo activity of two species. Parasitol Res (2010) 107:593–599 【9】 李时珍. 本草纲目. （我仅在duxiu网上下载了本草纲目中相关页面的电子 版，忘记版本信息了。Sorry） 【10】 《中国植物志》。（我仅从中国植物志网站上下载了相关页面，忘记版本信息了。Sorry） 【11】 《中华人民共和国药典》，1953年版；1953年版第一增补本；1963年版；1977年版；2005年版。（我仅从duxiu网下载该药典的相关页面，没有记录更具体的版本信息。Sorry） 【12】 屠呦呦. 青蒿及青蒿素类药物. 化学工业出版社. 2009. 【13】 张剑方.迟到的报道. 羊城晚报出版社。 【14】 张艺谋导演.大红灯笼高高挂。
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